FVIII/ET3の移植

Nature Communications volume 14、記事番号: 4206 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

血友病 A は、世界中で 50 万人以上が罹患している最も一般的な X 染色体関連出血疾患です。重度の血友病 A 患者は、凝固 FVIII レベルが 1% 未満であり、自然に衰弱し、生命を脅かす出血を経験します。血友病 A 治療法の進歩により、健康転帰は大幅に改善されましたが、FVIII 阻害抗体の開発と治療中の突出出血により、患者の罹患率と死亡率が大幅に増加しています。今回我々は、人間の在胎週数16～18週に相当するヒツジの胎児を用い、最適化されたFVIIIタンパク質を産生するように生物工学的に操作されたヒト胎盤細胞の出生前移植（107～108/kg）により、血漿FVIIIレベルが大幅に上昇することを示す。治療後3年以上持続します。細胞は主要な臓器に生着しますが、レシピエントは細胞または細胞が産生する第 VIII 因子のいずれに対しても免疫応答を開始しません。したがって、これらの研究は、出生前に血友病 A を治療することの実現可能性、免疫学的利点、および安全性を証明しています。

血友病 A (HA) は最も一般的な X 連鎖出血疾患であり、男性の出生 10 万人あたり 24.6 人で発生し、世界中で 50 万人以上が罹患しています1。重度の HA (PHA) 患者は、FVIII 活性の血漿レベルが正常の 1% 未満であり、結合組織/筋肉血腫、内出血、慢性衰弱性関節症につながる血腫などの生命を脅かす自然出血に耐えます2。現在の治療法の最新の進歩により、標準治療が大幅に進歩した 3 にもかかわらず、関節疾患により、最初の 50 日以内に患者の 25 ～ 40% で阻害抗体が発現するなど、PHA における疾患の負担は依然として高い。 FVIII への感染が多く、突出出血や生命を脅かす出血の予防は依然として課題です4,5。

最近の研究では、血友病を持って生まれた人が通常の期間および質の生活を送る可能性は、高所得国では 33%、低所得国では 93% 減少することが実証されました1。これらの厳粛な統計は、これらの患者の生存率と生活の質を向上させるための新しい治療法の開発を必要とする、満たされていない緊急の臨床ニーズが依然として存在することを示しています。

子宮内移植（IUTx）を用いた出生前期の遺伝性疾患の治療は、何十年にもわたって、思いやりのある使用のもとでヒトに対して安全に行われてきました6。最近、α-サラセミア（NCT02986698）、骨形成不全症（NCT03706482）、またはリソソーム蓄積症（NCT04532047）の胎児を治療するためにIUTxを使用する安全性と実現可能性を確立するために被験者を募集する臨床試験が開始されました。これらの試験は、単一遺伝子性疾患の患者をどのように治療するかという視点において切望されていた変化を証明し、妊婦と罹患被験者の両方に対するこの種の処置の安全性をさらに確立しました7。

HA 患者の約 70% にこの疾患の家族歴があるため、出生前診断と介入が可能です。治癒可能な、または重度の生命を脅かす出血性疾患を軽度の表現型に変換するのに十分なFVIIIレベルを提供し、同時にFVIII産物に対する免疫寛容を誘導し、それによってFVIII阻害剤形成のリスクを排除できる出生前治療の開発。、HA 患者の平均余命と生活の質に大きな有益な影響を与え、HA 治療における標準治療を変革するでしょう 8,9。

子宮内遺伝子治療は前臨床研究で大きな期待が示されているが 10、in vitro での細胞の形質導入により、ベクターの直接注入では不可能な産生時の安全策が可能となり、望ましくない組織/細胞、例えば生殖系列の組織/細胞に不用意に形質導入するリスクが排除されます。さらに、生体内で生理学的に増殖し、臨床治療レベルの FVIII を分泌する細胞を使用する IUTx は、HA6 の長期/永続的な矯正を提供するための有望かつ安全なアプローチです。我々は最近、ヒト胎盤細胞（PLC）が、骨髄性コドン最適化された生物工学処理されたFVIII（PLC-mcoET3）をコードするレンチベクターで形質導入された場合、in vivoでFVIIIを産生および分泌するための優れた細胞プラットフォームであることを報告しました11。今回我々は、野生型ヒツジをIUTxの大型動物モデルとして用い、ヒトにおいて妊娠16～18週（gw）に相当する量でPLC-mcoET3を投与すると、血漿FVIIIレベルが対照非投与者の血漿FVIIIレベルを上回る上昇をもたらしたことを実証する。 - 生後 3 年を超える間、体重が急速かつ大幅に増加したにもかかわらず、IUTx 動物の増加率は 48.4 ± 12.3% を超え、治療に関連した毒性の証拠はなく、抗 FVIII/ET3 IgG、FVIII 阻害剤、またはET3 特異的な Th1 または Th2 細胞。さらに、IUTx治療を受けたレシピエントは、移植されたヒトPLCに対する免疫や抗HLA抗体を発現しないが、外来抗原に対する強い反応性を維持していることを示した。 RNA および DNA 分析により、すべての主要臓器でベクターにコードされた mcoET3 が生着し、継続的に発現していることが証明されました。この療法により、困難な出産にもかかわらず、HA 羊の出血もなくなりました。したがって、これらの研究は、出生前期間における HA の治療の実現可能性、免疫学的利点、および安全性を証明しています。

2 SD above the mean OD from ELISAs performed with control sheep plasma (dotted line). During the first year post-IUTx, none of the treated animals developed anti-ET3 IgM or IgG antibodies, but during year 2, c a low-titer (1:20) anti-ET3 IgG antibody was detected in one animal (17010). This animal was closely followed with subsequent anti-ET3 IgG antibody testing, and data showed that (d) the anti-ET3 IgG antibody measured at different time points (n = 5) was either a transient non-inhibitor antibody, since FVIII levels remained high, or an assay artifact as subsequent samples from this animal were devoid of anti-ET3 IgG. Data are shown as Mean ± SEM. Source data are provided as a Source Data file./p>2, and >10 SFU/2 × 105 PBMC (dotted line). IUTx recipients (n = 13 animals) had no ET3-specific Th1 or Th2 lymphocytes, while their lymphocytes maintained the ability to react and secrete IFN-γ and IL-4 when stimulated with Phytohemagglutinin-L (PHA-L); c None of the IUTx animals’ (n = 13 animals) lymphocytes proliferated in the presence of same-donor PLC-mcoET3 (T) or same-donor non-transduced PLC (NT), when tested by one-way MLRs, but maintained significant proliferative response to third party human PBMC. For each animal, MLR assays were performed in triplicate at two different time points. Data are shown as Mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test was used to determine significant differences. p ≤ 0.05 was considered significant. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. Source data are provided as a Source Data file./p>

0.999; 0.1818; 0.8041; spleen p = 0.0763; 0.0702; 0.1244; >0.9999; 0.9906; 0.9854; lung p = 0.0845; 0.8127; 0.8366; >0.9999; thymus p = 0.9818; 0.8695; 0.0755; 0.144; 0.9785. Source data are provided as a Source Data file./p>30% of PHA develop FVIII inhibitors28,29. Importantly, both persons with severe30 and non-severe HA31 who develop inhibitors have an increased mortality risk. Also of note is that some patients can experience spontaneous bleeding starting during the neonatal period or infancy. Reports show that 9.5% of HA newborns need replacement treatment within the first 24 h after birth, and 44% have a bleeding episode by 1 mo.26,27. Moreover, infants suffer cranial (24%), oral (30%), soft tissue (7%), and joint (16.2%) bleeds26,27. Thus, even a 5% increase in FVIII activity during the neonatal period could avert early bleeding events. Therefore, these patients could greatly benefit from early intervention./p>48.4 ± 12.3%, for >3 years after birth. The FVIII activity levels determined by FVIII activity assays were also confirmed by LC-MS, which, in addition, demonstrated that ET3 protein was present in the plasma of treated animals. Furthermore, in seven out of eight animals, FVIII levels at 1-year post-IUTx did not differ significantly from those at 3 years post-IUTx, and the one animal in which levels of FVIII declined still maintained FVIII levels >5% above normal. Interestingly, higher plasma FVIII levels were not detected in animals that received higher cell doses, or cells with higher FVIII secretion. Importantly, none of the treated animals developed anti-FVIII/ET3 IgM or IgGs, or ET3-specific Th1 or Th2 cells. This is in contrast to what was reported in another study using juvenile sheep that received the exact same therapy (PLC-mcoET3) by the same administration route (IP), and in which 66% of animals developed anti-FVIII/ET3 IgGs and low titers of anti-FVIII and anti-ET3 inhibitory antibodies13./p>15% FVIII, which is intended to provide effective protection from the majority of spontaneous bleeds25. Since at 3 years after IUTx, the average plasma levels of FVIII were 48.4 ± 12.3% above the control, this approach could also provide enough factor to control other acute bleeds, in particular, subclinical bleeds and those associated with traumas, surgery, and/or intense physical activity25. Nevertheless, confirmation of phenotypic correction by evaluating whether the annualized bleeding rate is significantly reduced from baseline throughout the lifetime of HA animals, and evidence that an immune response is still not present in these animals is a must to ascertain the true clinical impact of this prenatal approach./p> 5 IU./p>

2 SD above the mean OD from control sheep plasma (n = 4) Supplementary Fig. 7a, b./p>

2 (Stimulation Index >2); and (2) a threshold minimum of 10 SFU/2 × 105 PBMC was reached./p>

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